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實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒的常見問題及解決策略
點(diǎn)擊次數(shù)：1159 更新時(shí)間：2024-06-25
實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Quantitative Real-Time PCR，簡稱qRT-PCR）技術(shù)，因其高靈敏度、高特異性和高定量準(zhǔn)確性，已成為分子生物學(xué)研究中不可少的工具。然而，在實(shí)際使用過程中，實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒經(jīng)常會遇到一些常見問題，影響了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。本文將對這些問題進(jìn)行梳理，并提出相應(yīng)的解決策略。
一、常見問題
1.無CT值（信號）出現(xiàn)
無CT值出現(xiàn)是qRT-PCR實(shí)驗(yàn)中最為常見的問題之一。可能的原因包括：反應(yīng)循環(huán)數(shù)不足、檢測熒光信號的步驟有誤、引物或探針降解、引物或探針設(shè)計(jì)不合理、模板量不足或模板降解等。
2.CT值出現(xiàn)過晚
CT值出現(xiàn)過晚通常意味著PCR擴(kuò)增效率較低。可能的原因包括：擴(kuò)增效率低、PCR反應(yīng)過程中退火及延伸的時(shí)間過短或過長、MgCl2濃度不合適、循環(huán)數(shù)設(shè)置不足、引物或探針設(shè)計(jì)有誤等。
3.標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系不佳
標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系不佳通常意味著PCR反應(yīng)中存在不穩(wěn)定因素，影響了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的定量準(zhǔn)確性。可能的原因包括：加樣存在誤差、標(biāo)準(zhǔn)品出現(xiàn)降解等。
二、解決策略
1.針對無CT值出現(xiàn)的解決策略
（1）確保反應(yīng)循環(huán)數(shù)足夠。一般而言，循環(huán)數(shù)應(yīng)設(shè)置在35至45個(gè)之間，避免背景信號過高影響結(jié)果。
（2）檢查熒光信號檢測步驟是否正確。根據(jù)試劑盒說明書或?qū)嶒?yàn)方法，確保在正確的PCR反應(yīng)步驟中采集熒光信號。
（3）通過PAGE電泳檢測引物和探針是否降解。若發(fā)現(xiàn)降解現(xiàn)象，應(yīng)重新制備引物和探針。
（4）優(yōu)化引物和探針的設(shè)計(jì)。根據(jù)目的基因的特性，設(shè)計(jì)合適的引物和探針，避免引物跨越內(nèi)含子或探針設(shè)計(jì)在擴(kuò)增片段的5'端等可能導(dǎo)致擴(kuò)增效率低的問題。
（5）確保模板量足夠且未降解。對于未知濃度的樣品，應(yīng)從系列稀釋樣本的最高濃度做起，避免模板量不足導(dǎo)致無CT值出現(xiàn)。同時(shí)，注意樣品的儲存條件，避免反復(fù)凍融導(dǎo)致模板降解。
2.針對CT值出現(xiàn)過晚的解決策略
（1）優(yōu)化PCR反應(yīng)條件。如適當(dāng)降低退火溫度、調(diào)整延伸時(shí)間等，以提高PCR擴(kuò)增效率。
（2）檢查MgCl2濃度是否合適。按0.5mM的間距調(diào)整MgCl2的濃度，找到適合本實(shí)驗(yàn)條件的濃度。
（3）重新設(shè)計(jì)引物和探針。若引物或探針設(shè)計(jì)不合理，可能導(dǎo)致擴(kuò)增效率低，應(yīng)重新設(shè)計(jì)并優(yōu)化。
（4）確保PCR產(chǎn)物長度合適。PCR產(chǎn)物長度一般應(yīng)在80至150bp之間，過長或過短都可能影響擴(kuò)增效率。
3.針對標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系不佳的解決策略
（1）確保加樣準(zhǔn)確。注意每次加樣的一致性及移液器的校正，避免加樣誤差導(dǎo)致標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系不佳。
（2）確保標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量穩(wěn)定。避免標(biāo)準(zhǔn)品反復(fù)凍融或長時(shí)間儲存導(dǎo)致降解，應(yīng)重新制備并稀釋標(biāo)準(zhǔn)品。
實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒在使用過程中可能會遇到各種問題，但通過仔細(xì)排查原因并采取相應(yīng)的解決策略，可以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。
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