實驗報告：

一、分離與培養(yǎng)：

1、無菌條件下，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織，然后用PBS將此組織塊清洗2次，將組織剪成1mm3左右大小；

2、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶），混懸10s，置37℃條件下消化10min，之后用滴管吹打制成單細(xì)胞懸液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培養(yǎng)基終止消化后4℃放置；

3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液，混懸10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置，重復(fù)此步驟2-3次，直至組織被消化；

4、用200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾細(xì)胞消化液，1200r/min 離心10min，棄去上清，沉淀細(xì)胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養(yǎng)基混懸，接種于25cm2培養(yǎng)瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

5、差速貼壁1h后，吸出培養(yǎng)基，按實驗需要接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)；二、免疫熒光鑒定：

1、待心房肌細(xì)胞生長至80%融合時，棄去培養(yǎng)基，用溫育的PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細(xì)胞15min；

2、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在室溫條件下，用4% BSA封閉細(xì)胞30min；

4、按1: 100的比例稀釋α-actin一抗，然后將其放在4℃冰箱中孵育細(xì)胞過夜；

5、PBS沖洗細(xì)胞3次，每次10min，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗， 37℃條件下放置1h；

6、用PBS沖洗3次，每次10min，在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。

細(xì)胞簡介：

人淋巴血管內(nèi)皮分離自淋巴管組織；淋巴管由毛細(xì)淋巴管匯合而成。其形態(tài)結(jié)構(gòu)與靜脈相似，但管徑較細(xì)，管壁較薄，瓣膜較多且發(fā)達(dá)，外形呈串珠狀。淋巴管根據(jù)其位置分為淺、深二種。它們管位于皮下，常與淺靜脈伴行，收集皮膚和皮下組織的淋巴。深淋巴管與深部血管伴行，收集肌肉和內(nèi)臟的淋巴。淺、深淋巴管之間有廣泛的交通支。淋巴管在向心行程中，通常經(jīng)過一個或多個淋巴結(jié)，從而把淋巴細(xì)胞帶入淋巴液。主要功能是濾過淋巴液，產(chǎn)生淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞，參與機體的免疫反應(yīng)。當(dāng)局部感染時，細(xì)菌、病毒或癌細(xì)胞等可沿淋巴管侵入，引起局部淋巴結(jié)腫大。如該淋巴結(jié)不能阻止和消滅它們，則病變可沿淋巴管的流注方向擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移。淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞（LEC）是襯覆于淋巴管內(nèi)表面的一種單層扁平上皮，是構(gòu)成淋巴管壁的主要結(jié)構(gòu)，參與維持體液平衡，調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞再循環(huán)和機體的免疫反應(yīng)和組織液及蛋白質(zhì)的運輸，在疾病過程中也起著重要作用。近年研究表明，LEC還在傷口愈合、淋巴管水腫和炎癥擴(kuò)散等病理過程中起重要作用，而且與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞主要功能：①調(diào)節(jié)體液、蛋白和組織壓力平衡；②為免疫系統(tǒng)的重要組成部分。淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞與主要病生理變化：①囊腫型淋巴管瘤；②淋巴管炎；③淋巴結(jié)核。

方法簡介：

公司實驗室分離的人淋巴血管內(nèi)皮采用-膠原酶聯(lián)合消化法制備而來，細(xì)胞總量約為5×10?cells/瓶。

質(zhì)量檢測

公司實驗室分離的人淋巴血管內(nèi)皮經(jīng)CD31免疫熒光鑒定，純度可達(dá)90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、細(xì)菌、酵母和真菌等。

培養(yǎng)信息：

包被條件 PLL（0.1mg/ml），明膠（0.1%）

培養(yǎng)基 含FBS、生長添加劑、Penicillin、Streptomycin等

換液頻率 每2-3天換液一次

生長特性 貼壁

細(xì)胞形態(tài) 內(nèi)皮細(xì)胞樣

傳代特性 可傳3代左右

消化液 0.25%

培養(yǎng)條件 氣相：空氣，95%；CO2，5%

注意事項：

1. 收到細(xì)胞后首先觀察細(xì)胞瓶是否完好，培養(yǎng)液是否有漏液、渾濁等現(xiàn)象，若有上述現(xiàn)象發(fā)生請及時和我們聯(lián)系。

2. 仔細(xì)閱讀細(xì)胞說明書，了解細(xì)胞相關(guān)信息，如細(xì)胞形態(tài)、所用培養(yǎng)基、血清比例、所需細(xì)胞因子等，確保細(xì)胞培養(yǎng)條件一致，若由于培養(yǎng)條件不一致而導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)問題，責(zé)任由客戶自行承擔(dān)。

3. 用75%酒精擦拭細(xì)胞瓶表面，顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)。因運輸問題，部分細(xì)胞由于溫度變化及劇烈碰亡破碎形成碎片，是正常現(xiàn)象。觀察好細(xì)胞狀態(tài)后，75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置于37℃培養(yǎng)箱放置4-6h。

4. 貼壁細(xì)胞可以消化，懸浮細(xì)胞直接混勻收集細(xì)胞，900 rpm-1000 rpm離心3 min，棄上清。加5 mL PBS重懸細(xì)胞，再900 rpm-1000 rpm離心3 min，，用新鮮的*培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，并接種到新的培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中，置于培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

5. 請客戶用相同條件的培養(yǎng)基用于細(xì)胞培養(yǎng)。

6. 建議客戶收到細(xì)胞后前3天各拍幾張細(xì)胞照片，記錄細(xì)胞狀態(tài)，便于和我司技術(shù)部溝通交流。由于運輸?shù)脑颍瑐€別敏感細(xì)胞會出現(xiàn)不穩(wěn)定的情況，請及時和我們聯(lián)系，告知細(xì)胞的具體情況，以便我們的技術(shù)人員跟蹤回訪直至問題解決。

7. 該細(xì)胞僅供科研使用。

8. 備注：運輸用的培養(yǎng)基(灌液培養(yǎng)基)不能再用來培養(yǎng)細(xì)胞，請換用按照說明書細(xì)胞培養(yǎng)條件新配制的*培養(yǎng)基來培養(yǎng)細(xì)胞。收到細(xì)胞后次傳代建議1：2傳代 。

9.注意： 1:2傳代就是1個T25瓶傳2個T25瓶或者2個6cm皿。不是1個T25瓶傳2個10cm皿。

公司正在出售的產(chǎn)品：

大鼠肉毒堿棕櫚酰基轉(zhuǎn)移酶2(CPT2)檢測試劑盒 ，英文名： CPT2 ELISA Kit

Mouse angiotensinogen (aGT) ELISA Kit 小鼠血管緊張素原(aGT)檢測試劑盒

RatThyroglobulin,TGELISAKit 大鼠甲狀腺球蛋白(TG)檢測試劑盒 96T/48T 進(jìn)口分裝

CLIAKitforGzms-A(MousegranzymesA)ELISAKit小鼠顆粒酶A

細(xì)胞長鏈羥脂酰脫氫酶(HYDROXYACYLCOADEHYDROGENASE)活性比色法定量檢測試劑盒20次

Raturokinaseplasminogenactivator,uPAELISAKit大鼠型纖溶酶原激活物(uPA)檢測試劑盒規(guī)格：96T/48T

NMNAT1重組人 NMNAT1 / NMNAT 蛋白 Protein

SPAG5/map126 相關(guān)抗原5(多肽抗原 0.5mgSPAG5/map126 相關(guān)抗原5(多肽抗原)

GPC3重組人 Glypican 3 / GPC3 / OCI-5 蛋白 Protein

HIST2H4A Protein Human 重組人 Histone H4 / HIST2H4A 蛋白

PTPN1 Protein Human 重組人 PTP1B / PTPN1 蛋白

SPAG5/map126 相關(guān)抗原5(多肽抗原 0.5mgSPAG5/map126 相關(guān)抗原5(多肽抗原)

HIST2H4A Protein Human 重組人 Histone H4 / HIST2H4A 蛋白

NMNAT1重組人 NMNAT1 / NMNAT 蛋白 Protein

PTPN1 Protein Human 重組人 PTP1B / PTPN1 蛋白

GPC3重組人 Glypican 3 / GPC3 / OCI-5 蛋白 Protein

小鼠N-乙酰-β-D-基葡萄糖苷酶(NAG)ELISA 試劑盒 96T/48T

Rat ferritin (FE) ELISA Kit 大鼠鐵蛋白(FE)檢測試劑盒

HumanDehydroepiandrosteronesulfate,DHEA-SELISAKit 人脫輕表雄酮硫酸酯(DHEA-S)檢測試劑盒 96T/48T 進(jìn)口分裝

HumanCobravenomneuronalprotectivefactor,CVNPF檢測試劑盒人神經(jīng)保護(hù)因子(CVNPF)檢測試劑盒規(guī)格：96T/48T

組織3-0酸甘油脫氫酶(GAPDH)活性酶動力比色法定量檢測試劑盒20次

HumaegulatedonactivationinnormalT-cellexpressedandsecreted,RAESELISAKit人正常T細(xì)胞表達(dá)和分泌因子(RAES/CCL5)檢測試劑盒規(guī)格：96T/48T

人淋巴血管內(nèi)皮細(xì)胞兔內(nèi)皮型合成酶檢測試劑盒   兔內(nèi)皮型合成酶試劑盒   規(guī)格型號：96T/48T   兔內(nèi)皮型合成酶試劑盒，規(guī)格型號：96T/48T，來源：檢測試劑盒（進(jìn)口分裝），產(chǎn)品別名：兔內(nèi)皮型合成酶試劑盒、兔內(nèi)皮型合成酶檢測試劑盒   保存條件：2-8℃   保質(zhì)期：6個月。

兔基質(zhì)金屬蛋白酶1檢測試劑盒   兔基質(zhì)金屬蛋白酶1試劑盒   規(guī)格型號：96T/48T   兔基質(zhì)金屬蛋白酶1試劑盒，規(guī)格型號：96T/48T，來源：檢測試劑盒（進(jìn)口分裝），產(chǎn)品別名：兔基質(zhì)金屬蛋白酶1試劑盒、兔基質(zhì)金屬蛋白酶1檢測試劑盒   保存條件：2-8℃   保質(zhì)期：6個月。

兔子白介素2檢測試劑盒   兔子白介素2試劑盒   規(guī)格型號：96T/48T   兔子白介素2試劑盒，規(guī)格型號：96T/48T，來源：檢測試劑盒（進(jìn)口分裝），產(chǎn)品別名：兔子白介素2試劑盒、兔子白介素2檢測試劑盒   保存條件：2-8℃   保質(zhì)期：6個月。

人α2巨球蛋白檢測試劑盒   人α2巨球蛋白試劑盒   規(guī)格型號：96T/48T   人α2巨球蛋白試劑盒，規(guī)格型號：96T/48T，來源：檢測試劑盒（進(jìn)口分裝），產(chǎn)品別名：人α2巨球蛋白試劑盒、人α2巨球蛋白檢測試劑盒   保存條件：2-8℃   保質(zhì)期：6個月。