產品僅供研究使用，不適用于人類或臨床診斷
商品屬性：

產品英文名稱：F-actin Staining Kit (Orange Fluorescence)

產品中文名稱：F-actin染色試劑盒（橙色熒光）

規格：50 T/300 T/1000 T

貨號：EY-01X8561
用途：僅供科研研究實驗

特點&優勢:

•  優化的實驗方案，特別適用于甲醛固定與透化處理的組織切片、細胞培養物或無細胞實驗中的F-actins標記，鑒定以及定量需求。

•  的鬼筆環肽染料 (橙色熒光) (Ex/Em = 593/614nm)，特異性地結合F-actins，且兼具比其它熒光素-鬼筆環肽偶聯物更強的光穩定性。

保存建議:請參閱說明書中各個組分的存儲條件。自發貨之日起，在推薦溫度下至少穩定6個月。

運輸條件:藍冰運輸

背景

鬼筆環肽（phalloidin），是從一種劇毒磨菇(Amanita phalloides)中分離出來的一種多肽物質，屬于毒傘肽類毒素，是一種強烈毒素。它是一種特異性結合F-肌動蛋白的雙環肽，因此，使用熒光染料偶聯的鬼筆環肽可以非常方便地研究F-actins的分布。在鬼筆環肽內部，半和之間存在不尋常的硫醚橋，可形成內環結構。當pH升高時，硫醚被裂解，鬼筆環肽喪失對肌動蛋白的親和力。

本產品具有下列特點:

 1.操作簡便、快捷。可直接加入到檢測平板。在96-孔板中檢測時,無需洗滌或收獲細胞,免去溶解步驟。

2. 無放射性。不需要配制液閃混合物,也不需要處理廢棄物。

3. 與MTT相比,使用更安全。不需要使用揮發性的有機溶劑來溶解甲臜產物。

4. 操作靈活,與MTT不同,平板讀數后可放回溫箱繼續孵育,使顏色進一步生成。

操作步驟：

(一)獲得目的基因

1、通過PCR方法:以含目的基因的克隆質粒為模板,按基因序列設計一對引物(在上游和下游引物分別引入不同的酶切位點),PCR循環獲得所需基因片段。

2、通過RT-PCR方法:用TRIzol法從細胞或組織中提取總RNA,以mRNA為模板,逆轉錄形成cDNA第一鏈,以逆轉錄產物為模板進行PCR循環獲得產物。

(二)構建重組表達載體

1、載體酶切:將表達質粒用限制性內切酶(同引物的酶切位點)進行雙酶切,酶切產物行瓊脂糖電泳后,用膠回收Kit或凍融法回收載體大片段。

2、PCR產物雙酶切后回收,在T4DNA連接酶作用下連接入載體。

(三)  獲得含重組表達質粒的表達菌種

1、 將連接產物轉化大腸桿菌DH5α,根據重組載體的標志(抗Amp或藍白斑)作篩選,挑取單斑,堿裂解法小量抽提質粒,雙酶切初步鑒定。

2、 測序驗證目的基因的插入方向及閱讀框架均正確,進入下步操作。否則應篩選更多克隆,重復亞克隆或亞克隆至不同酶切位點。

3、 以此重組質粒DNA轉化表達宿主菌的感受態細胞。

(四)誘導表達

1、挑取含重組質粒的菌體單斑至2ml LB(含Amp50μg/ml)中37℃過夜培養。

2、按1∶50比例稀釋過夜菌,一般將1ml菌加入到含50mlLB培養基的300ml培養瓶中, 37℃震蕩培養至OD600≌0.4-1.0(*0.6,大約需3hr)。

3、取部分液體作為未誘導的對照組,余下的加入IPTG誘導劑至終濃度0.4mM作為實驗組,兩組繼續37℃震蕩培養3hr。

4、分別取菌體1ml, 離心12000g×30s收獲沉淀,用100μl 1%SDS重懸,混勻, 70℃10min。

5、離心12000g×1min,取上清作為樣品,可做SDS-PAGE等分析。

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